Quick Cell 支原體快速檢測試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng))

產(chǎn)品描述

Quick Cell支原體快速檢測試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng))是專門用于快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清或別的液體樣品(如血清)中是否存在支原體污染的試劑。本試劑盒操作簡單，反應(yīng)時間短，只需吸取1 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清加入反應(yīng)體系中，60℃孵育1 h，肉眼觀察即可判定結(jié)果，與傳統(tǒng)檢測支原體的PCR法優(yōu)勢明顯。本試劑盒檢測范圍廣，可以檢測：(1)M.Hyorhinis、(2)M.Fermentans、(3)M.Arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma Laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis等幾乎所有常見的污染細(xì)胞的支原體(M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。因此非常適合于與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的科研實驗室及企業(yè)的日常支原體檢測。【注】：快速法不能檢測尿解，肺支原體。

訂購信息

產(chǎn)品組分

【注】：①本試劑盒所指50次測試包含陰性對照、陽性對照，并非50個樣品，因每次測試均需設(shè)置對照，測試樣品數(shù)根據(jù)實驗安排確定，理論上一次最多可測試48個樣品。②使用前用離心機(jī)輕微離心，以免管壁上粘附損失試劑減少檢測次數(shù)。（注：陽性支原體DNA無需離心。)

運輸與保存

藍(lán)冰運輸。-20℃保存，有效期36個月。

使用方法

1.待測細(xì)胞培養(yǎng)上清收集

　　為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品最好來源于至少培養(yǎng)3 d且匯合度70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)上清(貼壁細(xì)胞)。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長3 d再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，哺乳動物細(xì)胞的存在不會影響檢測結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接用于檢測，但樣品中如果含有EDTA等影響支原體DNA擴(kuò)增的成分，建議進(jìn)行樣品處理，處理過程如下：

樣品處理

(1)  根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取100-1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺式離心機(jī)上1000 rpm低速離心5 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi)，丟棄細(xì)胞沉淀。

(2)  將上清繼續(xù)13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 min，小心吸走全部上清，用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL 的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。

(3)  該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進(jìn)行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理過程：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉(zhuǎn)移到 PCR 管內(nèi)，在 PCR 儀上進(jìn)行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 sec）后，取上清進(jìn)行檢測。【注】：收集的待測細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存1個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節(jié)約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.反應(yīng)體系的配制

表1：恒溫反應(yīng)體系的配制

(1)  將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，室溫放置待其融化，溶液Ⅱ從-20℃冰箱中取出后置于冰上備用。溶液Ⅱ、Ⅲ使用前各需1000rpm離心30 sec，用移液槍吹洗均勻。三種試劑按表1比例混合。

例：①如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數(shù)為10個。溶液1的總體積為21.5×10×1.06=227.90 μL。溶液2的總體積為1×10×1.06=10.60 μL。溶液3的總體積為0.5×10×1.06=5.3 μL。將溶液1、溶液2和溶液3混合均勻即可。

②如果打算一個試劑盒一次使用完畢，可以按照以下方法進(jìn)行配制：直接往整管溶液1（1075 μL）中加入50 μL 溶液2和25 μL溶液3，混合均勻即可。如果一次使用完畢，一個試劑盒大概可以檢測48-49個樣品。

注：①總體積中多配制6%（如果覺得該比例不合適，可以自己調(diào)整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。

②溶液Ⅰ和溶液Ⅲ使用完后，請繼續(xù)放回-20 ℃冰箱中保存。

③溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存（溶液Ⅱ在-20 ℃不會凍?。?，不能放于室溫。

④溶液Ⅱ和溶液Ⅲ開蓋之前，請離心一下。

(2)  將上述配制好的恒溫反應(yīng)體系，吹打均勻后，按每管 23μL分裝到0.2 mL的PCR管中?！咀ⅰ浚孩俦M量保證每管的反應(yīng)液體積一樣。如果分裝時最后一管反應(yīng)液不足，可以將其作為陰性對照管；②PCR管應(yīng)該使用透明度良好的PCR管。

(3)  陰性對照管（Negative）可以加入 2μL滅菌水（自備，也可以不加）；往測試管（Test）中加入 2μL待測樣品；往陽性對照管（Positive）中加入 2μL陽性支原體DNA。反應(yīng)液的總體積為 25μL。【注】：①裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務(wù)必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結(jié)果可能異常。②進(jìn)行反應(yīng)體系配制的房間，與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間最好分開。

3. 反應(yīng)

PCR儀設(shè)置程序：61℃，60 min；10℃，forever；熱蓋溫度，105℃?！咀ⅰ浚喝魧嶒炇曳磻?yīng)場所沒有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實際溫度的溫差不超過0.5℃，另須往每個反應(yīng)管內(nèi)加入25μL礦物油，以防止水份揮發(fā)，然后蓋上蓋子，將反應(yīng)管插入帶孔的漂板內(nèi)，放入已經(jīng)升溫到61℃的水浴內(nèi)，準(zhǔn)確反應(yīng)60 min。

4. 結(jié)果判斷

61℃反應(yīng)60 min后，立刻取出反應(yīng)管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過反應(yīng)管溶液顏色的變化，即可判斷檢測結(jié)果。如果溶液為藍(lán)綠色，則說明有支原體污染；如果為紫紅色，則說明沒有支原體污染(如圖1)?！咀ⅰ浚?span style="color:black">如果反應(yīng) 60 min，陽性對照效果不明顯，可以繼續(xù)反應(yīng) 10 min。

注意事項

1.       本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.       必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體，盡量用新購移液器、新開封的槍頭操作。整個操作過程，佩戴口罩，不要開口說話。由于本試劑盒非常靈敏，移液槍如吸附有，或者人為帶入支原體均有可能造成假陽性。

3.       最好使用帶濾芯的吸頭吸取溶液和陽性支原體等。如果沒有帶濾芯的吸頭，至少應(yīng)該使用新開封的吸頭。

4.       檢測過程中，用過的各類吸頭、離心管務(wù)必小心處理，應(yīng)裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的垃圾瓶內(nèi)。反應(yīng)后的PCR管，不要開蓋，用過后將其用自封袋密閉，扔到遠(yuǎn)離細(xì)胞房的獨立垃圾桶內(nèi)。

5.       如果細(xì)胞被支原體污染，可以選購本公司或其他供應(yīng)商提供的去除試劑盡早去除。

6.       如待測樣品是低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等，這類樣品中支原體含量較低，為了保證支原體DNA的檢出率，可通過離心濃縮提高樣品DNA濃度，再進(jìn)行檢測。

7.       如果反應(yīng)后，發(fā)現(xiàn)個別樣品的顏色介于陽性和陰性之間（正常這種情況應(yīng)該概率很低，如果經(jīng)常出現(xiàn)，樣品中可能含有可干擾正常指示效果的物質(zhì)，必須先去除），可以將這些樣品繼續(xù) 61℃反應(yīng) 10  min。10  min后，如果其顏色仍然與陽性對照的顏色不同，該樣品應(yīng)該判為陰性。這種可疑樣品建議用相同試劑盒或者不同原理的其他試劑盒，如李記生物的Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L064）、Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）、Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L068）進(jìn)行復(fù)檢。

8.       反應(yīng)后，請勿打開反應(yīng)管的蓋子，否則有可能造成檢測環(huán)境的污染。

表2：Quick Cell 支原體快速檢測試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)專用)的優(yōu)勢

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